志贺氏菌参考检验方法（二） 志贺121℃高压灭菌15min

(八)SS琼脂

1、志贺基础培养基

成分：牛肉膏5g，氏菌脉胨5g，参考三号胆盐3.5g，检验琼脂17g，志贺蒸馏水1000mL。氏菌

制法：将牛肉膏、参考脲胨和胆盐溶解于400mI，检验蒸馏水中，志贺将琼脂加入于600mL蒸馏水中，氏菌煮沸，参考使其溶解，检验再将两液混合，志贺121℃高压灭菌15min，氏菌保存备用。参考

2、完全培养基

成分：基础培养基1000mL，

乳糖10g，柠檬酸钠8.5g，硫代硫酸钠8.5g，10％柠檬酸铁溶液10mL，1％中性红溶液2.5mL，O.1％煌绿溶液O.33mL。

制法：加热溶化基础培养基，按比例加入上述染料以外的各成分，充分混合均匀，校正pH至7.0，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板。

注：①制好的培养基宜当日使用，或保存冰箱内于48h内使用。

②煌绿溶液配好后应在lOd以内使用。

③可以购用SS琼脂的干燥培养基。

(九）三糖铁琼脂

成分：蛋白胨20g，牛肉膏5g，乳糖lOg，蔗糖lOg，葡萄糖1g，氯化钠5g，硫酸亚铁铵(Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂0］0.2g，硫代硫酸钠0.2g，琼脂12g，酚红0.025g，蒸馏水1000mL，pH7.4。

制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂煮沸溶化，加入0.2％酚红水溶液12.5mL，摇匀，分装试管，121℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用。

(十)蛋白胨水(靛基质试验用)

成分：蛋白胨(或胰蛋白胨)20g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.4。

制法：按上述成分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min。

靛基质试剂：

柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。

欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95％酒精内，然后缓慢加入浓盐酸20mL。

试验方法：接种培养物36±1℃培养1～2d，加柯凡克试剂约0.5 mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色。或加欧一波试剂约0.5mL，沿管壁流下覆盖于培养基表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨应先用已知菌种鉴定后方可使用。

(十一)尿素琼脂(pH7.2)

成分：蛋白胨1g，氯化钠1g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾1g，O.4％酚红溶液2g，琼脂3mL，蒸馏水20g，20％尿素溶液1000mL，pH7.2。

制法：将除尿素和琼脂以外的成分配好，校正pH，加入琼脂煮沸溶化，分装烧瓶，121⁰C高压灭菌15min，冷至50～55℃加入经除菌过滤的尿素溶液，分装于灭菌试管内，放成斜面备用。

试验方法：接种培养物36±1℃培养24h，观察结果，尿素酶阳性者，由于产碱而使培养基变为红色。

(十二)氰化钾(KCN)培养基

成分：蛋白胨1g，氯化钠5g，磷酸二氢钾0.225g，磷酸氢二钠5.64g，蒸馏水1000mL，O.5％氰化钾溶液20mL，pH7.6。

制法：将除氰化钾以外的成分配好，分装烧瓶，121℃高压灭菌15min，放在冰箱内使其充分冷却，每100mL培养基加入0.5％氰化钾溶液2mL(最后浓度为1:10000)，分装灭菌试管，每管约4mL，立刻用灭菌橡皮塞塞紧，放4℃冰箱保存，同时将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。

(十三)氨基酸脱羧酶试验培养基

成分：蛋白胨5g，酵母浸膏3g，葡萄糖1g，蒸馏水1000mL，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，L-氨基酸或DL氨基酸0.5或1g／100mL。

制法：除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1％加入，校正pH至6.8，对照培养基不加氨基酸，分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。

试验方法：接种培养物于36±1℃培养18-24h，观察结果，氨基酸脱羧酶阳性者，由于产碱培养基应呈紫色，阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色，对照管应为黄色。

(十四)糖发酵管

成分：牛肉膏5g，蛋白胨lOg，氯化钠3g，磷酸氢二钠2g，0.2％溴麝香草酚蓝溶液12mL，蒸馏水1000mL，pH7.4。

制法：葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5％加入葡萄糖，分装于有倒管的试管内，121℃高压灭菌15min。其他各种糖发酵管，可按上述成分配好后分装每瓶100 mL，121⁰C高压灭菌15 min，另将各种糖类分别配成10％溶液，同时高压灭菌，将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。

注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。

(十五)ONPG培养基

成分：邻硝基酚β-D半乳糖苷(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside ONPG) 60mg，0.01mol／L磷酸钠缓冲液(pFl7.5) 10mL，1％蛋白胨水(pI-17.5) 30mL。

制法：将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装试管，每管O.5mL，用橡皮塞塞紧。

试验方法：由琼脂斜面上挑取培养物1满环接种，于361℃培养1～3h或24h观察结果，如果β-半乳糖苷酶产生，则于1-3h变黄色，如无此酶则24h不变色。

(十六)半固体琼脂

成分：蛋白胨lg，牛肉膏0.3g，氯化钠O.5g，琼脂O.35～0.4g，蒸馏水100mL。

制法：按上述成分配好，煮沸溶解，校pH为7.4，分装小试管，121⁰C高压灭菌15min，直立凝固备用。

(十七)缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和V-P试验用)

成分：磷酸氢二钾5g，多胨7g，葡萄糖5g，蒸馏水1000mL，pH7.O。

制法：溶化后校iE pH，分装试管，每管1-2mL，121⁰C高压灭菌15min。

甲基红试验：接种培养物于36±1℃培养2-4天，滴加试剂一滴，立即观察结果，鲜红色为阳性，黄色为阴性。

甲基红试剂配法：10mg甲基红溶于30mL，乙醇中，然后加入20mL蒸馏水。

V—P试验：接种培养物予36±1℃培养2～4天，加入6％α-萘酚酒精溶液0.5mL和40％氢氧化钾溶液0.2mL，充分振摇观察结果，阳性者立刻或数分钟呈红色，如阴性时应于36℃培养4h再进行观察。

(十八)丙二酸钠培养基

成分：酵母膏1g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾0.6g，磷酸二氢钾0.4g，氯化钠2g，丙二酸钠3g，0.2%溴麝香草酚蓝溶液12mL，蒸馏水1000mL，pH6.8。

制法：先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再加指示剂，分装试管，121℃高压灭菌15min。

接种培养物于36±1℃培养48h，阳性者由绿色变为蓝色。

(十九)氧化酶试验

1％盐酸二甲基对苯二胺溶液：小量新鲜配制，于冰箱内避光保存。

1％α-萘酚乙醇溶液。

试验方法：取白色洁净滤纸沾取菌落，加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深，再加α-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色，阴性于2min内不变。

以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。

(二十)WS琼脂

成分：

豚胨12g，牛肉膏3g，氯化钠5g，乳糖12g，蔗糖12g，十二烷基硫酸钠2g，琼脂15g，Andrade指示剂20mL，O.4％溴麝香草酚蓝溶液16mL，甲液20mL，蒸馏水1000mL，pH7.0。

制法：

除指示剂和甲液外，将其他成分加热溶解，不需消毒，校正pH后加入指示剂和甲液，倾注平板，应呈草绿色。

注：①供沙门氏菌分离用。

②Andrade指示剂和甲液的配制均见HE琼脂。

参考资料：食品卫生微生物检验标准手册

相关链接：硫酸亚铁铵，培养基，丙二酸钠，十二烷基硫酸钠

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